摘要：研究首次揭示了人類造血干細胞（HSC）克隆在穩態造血中具有穩定且獨特的譜系貢獻模式。
在人體這個精密的生命機器中，每秒鐘都有數百萬血細胞被更新，這個過程由造血干細胞（HSC）持續不斷地分化補充來維持。然而，關于人類HSC在穩態造血過程中如何貢獻不同血細胞譜系的問題，長期以來缺乏直接證據。以往的研究只能在單個時間點觀察HSC克隆的貢獻，且未能同時評估關鍵的紅系和血小板譜系。更重要的是，由于人類體內存在5萬-20萬個活躍貢獻的HSC，追蹤單個HSC克隆的命運變得異常困難。
隨著年齡增長，HSC會積累體細胞突變，其中一些突變如DNMT3A、TET2等能夠賦予克隆生長優勢而不影響血細胞發育，這種現象稱為克隆性造血（CH）。這為研究者提供了一個獨特的機會——利用這些突變作為天然標記來追溯擴展HSC克隆的譜系貢獻。
在這項發表于《Nature Genetics》的研究中，Tetsuichi Yoshizato等科學家對93名健康老年人（24-91歲，多數≥70歲）的骨髓樣本進行了深入分析。他們通過錯誤校正靶向測序技術（ECTS）篩查了23個CH常見突變基因，在71名個體中鑒定出211個體細胞CH驅動突變。隨后利用高靈敏度的微滴數字PCR（ddPCR）技術，對純化的HSC、各譜系祖細胞和成熟血細胞進行突變檢測，追蹤了57個HSC來源克隆的譜系貢獻。
研究團隊發現HSC克隆僅表現出三種穩定的譜系貢獻模式：平衡貢獻全部五系血細胞（血小板、紅細胞、髓系細胞、B細胞和T細胞，稱為PEMBT模式）；貢獻所有髓系譜系但不貢獻或極少貢獻T細胞（PEMB模式）；以及僅貢獻髓系譜系（血小板、紅細胞和髓系細胞，稱為PEM模式）。值得注意的是，約44%的克隆表現為PEMB限制或偏倚，23%為PEM限制或偏倚，而僅有26%顯示平衡的多系貢獻。
圖1 譜系限制性干細胞對人類造血的穩定克隆貢獻
為了探究這些譜系限制模式是否由CH驅動突變引起，研究人員進行了系統發育分析。通過單細胞衍生克隆的全基因組測序（WGS），他們重建了系統發育樹，發現PEM限制的克隆早在數十年前就已經確立其命運決定，且這些模式在不同CH驅動突變（如DNMT3A、TET2、ASXL1等）中廣泛分布，表明譜系限制并非主要由特定驅動突變決定。
特別有趣的是，研究發現DNMT3A突變的HSC克隆顯著富集于PEMBT模式，這可能是因為這些克隆通常在生命早期出現，當時HSC仍能主動補充長壽的T細胞。而隨著衰老，HSC逐漸失去T細胞再生能力，從而更多表現為PEMB或PEM模式。
為了確認B細胞貢獻是否反映持續的B淋巴細胞生成而非長壽B細胞的持久存在，研究人員檢測了克隆來源的CD34+CD19+B祖細胞（pro-B細胞）。結果顯示，在有成熟B細胞貢獻的HSC克隆中，pro-B細胞也存在相似的突變細胞分數（MCF），證明這是持續的B淋巴細胞生成過程。
更重要的是，移植實驗證實了譜系限制是HSC內在編程的特性。將來自同一供體的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到免疫缺陷NSG小鼠后，它們保持了與在人體內相同的譜系貢獻模式——能夠貢獻B細胞的克隆在小鼠中仍產生B細胞，而不能貢獻B細胞的克隆在小鼠中也無法產生B細胞。
前瞻性分析顯示，這些HSC克隆的譜系貢獻模式在長達65個月的觀察期內保持驚人穩定，無論是平衡的多系貢獻還是譜系限制/偏倚的模式，都未隨時間發生顯著變化。
系統發育分析揭示了HSC克隆譜系貢獻的兩種演變模式："等級"模式，即后代亞克隆比祖先克隆表現出更高程度的譜系限制（從PEMBT向PEMB或PEMB向PEM演變）；和更常見的"穩定"模式，即盡管與祖先克隆分離數十年，后代克隆仍顯示出高度一致的譜系貢獻模式。
本研究首次在人類中全面描繪了HSC克隆在穩態造血中的譜系貢獻模式，揭示了HSC存在穩定的內在譜系限制程序。這一發現不僅深化了對人類造血發育和衰老的理解，也為血液系統疾病的起源和治療提供了重要啟示。特別是這些譜系限制的HSC可能作為基因組改變的儲存庫，是不同譜系歸屬血液系統惡性腫瘤的起源細胞。
研究采用的幾個關鍵技術方法包括：1）通過錯誤校正靶向測序（ECTS）技術篩查骨髓樣本中的CH突變；2）利用流式細胞術分選純化HSC、各譜系祖細胞和成熟血細胞；3）采用微滴數字PCR（ddPCR）進行高靈敏度突變定量檢測；4）對單細胞衍生克隆進行全基因組測序（WGS）并重建系統發育樹；5）通過免疫缺陷NSG小鼠移植模型驗證HSC的譜系貢獻能力。
A limited repertoire of HSC lineage replenishment patterns
研究人員通過追蹤57個HSC來源克隆的譜系貢獻，發現人類HSC僅表現出三種穩定的譜系貢獻模式：PEMBT（平衡貢獻所有五系）、PEMB（貢獻髓系但不貢獻T細胞）和PEM（僅貢獻髓系）。這些模式在不同CH驅動突變中廣泛分布，表明譜系限制并非主要由特定驅動突變決定。
Phylogenetic analysis infers stable HSC lineage replenishment
系統發育分析顯示，PEM限制的克隆早在數十年前就已經確立其命運決定。研究發現HSC克隆的譜系貢獻模式在系統發育樹中保持穩定，后代亞克隆即使經過數十年進化，仍保持與祖先克隆高度一致的譜系貢獻模式。
HSC clonal lineage restriction is intrinsically programmed
移植實驗證實譜系限制是HSC內在編程的特性。將來自同一供體的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到NSG小鼠后，它們保持了與在人體內相同的譜系貢獻模式，證明這種限制不是由骨髓微環境等外在因素決定的。
Prospective analysis reveals stable HSC lineage replenishment
前瞻性分析顯示，22個HSC克隆家族的譜系貢獻模式在長達65個月的觀察期內保持穩定，無論是平衡的多系貢獻還是譜系限制/偏倚的模式都未隨時間發生顯著變化，證明了HSC克隆命運決定的長期穩定性。
圖2 追溯長效造血干細胞克隆的起源
該研究得出結論，人類HSC在穩態造血中表現出穩定且可預測的譜系貢獻模式，這些模式由HSC內在程序決定，并在數十年間保持穩定。除了能夠貢獻全部五系血細胞的多能HSC外，還存在譜系限制性的HSC群體，包括PEMB限制（貢獻髓系但不貢獻T細胞）和PEM限制（僅貢獻髓系）的HSC克隆。這些譜系限制模式并非主要由CH驅動突變引起，而是反映了HSC固有的分化程序。
這一發現對理解造血生物學具有重要意義：首先，它揭示了人類HSC在穩態造血中的功能異質性，挑戰了傳統認為所有HSC都具有同等多能性的觀點；其次，研究發現HSC的譜系貢獻模式在數十年間保持穩定，說明HSC的分化命運是預先編程的且具有長期記憶性；最后，這些譜系限制的HSC可能成為特定血液系統疾病的細胞起源，為預防和治療年齡相關血液疾病提供了新的思路。
研究還發現，隨著衰老進程，能夠貢獻全部五系（包括T細胞）的HSC克隆逐漸減少，而譜系限制的HSC克隆增加，這可能是造血系統衰老的重要機制之一。值得注意的是，DNMT3A突變的HSC克隆更傾向于保持多系分化能力，這可能與它們通常在生命早期出現有關，當時HSC仍能主動補充長壽的T細胞池。
這些發現將促使科學界重新思考HSC的功能異質性及其在健康和疾病中的作用，為靶向特定HSC群體的治療策略奠定基礎。
參考資料
[1] Stable clonal contribution of lineage-restricted stem cells to human hematopoiesis
摘要：研究首次揭示了人類造血干細胞（HSC）克隆在穩態造血中具有穩定且獨特的譜系貢獻模式。
在人體這個精密的生命機器中，每秒鐘都有數百萬血細胞被更新，這個過程由造血干細胞（HSC）持續不斷地分化補充來維持。然而，關于人類HSC在穩態造血過程中如何貢獻不同血細胞譜系的問題，長期以來缺乏直接證據。以往的研究只能在單個時間點觀察HSC克隆的貢獻，且未能同時評估關鍵的紅系和血小板譜系。更重要的是，由于人類體內存在5萬-20萬個活躍貢獻的HSC，追蹤單個HSC克隆的命運變得異常困難。
隨著年齡增長，HSC會積累體細胞突變，其中一些突變如DNMT3A、TET2等能夠賦予克隆生長優勢而不影響血細胞發育，這種現象稱為克隆性造血（CH）。這為研究者提供了一個獨特的機會——利用這些突變作為天然標記來追溯擴展HSC克隆的譜系貢獻。
在這項發表于《Nature Genetics》的研究中，Tetsuichi Yoshizato等科學家對93名健康老年人（24-91歲，多數≥70歲）的骨髓樣本進行了深入分析。他們通過錯誤校正靶向測序技術（ECTS）篩查了23個CH常見突變基因，在71名個體中鑒定出211個體細胞CH驅動突變。隨后利用高靈敏度的微滴數字PCR（ddPCR）技術，對純化的HSC、各譜系祖細胞和成熟血細胞進行突變檢測，追蹤了57個HSC來源克隆的譜系貢獻。
研究團隊發現HSC克隆僅表現出三種穩定的譜系貢獻模式：平衡貢獻全部五系血細胞（血小板、紅細胞、髓系細胞、B細胞和T細胞，稱為PEMBT模式）；貢獻所有髓系譜系但不貢獻或極少貢獻T細胞（PEMB模式）；以及僅貢獻髓系譜系（血小板、紅細胞和髓系細胞，稱為PEM模式）。值得注意的是，約44%的克隆表現為PEMB限制或偏倚，23%為PEM限制或偏倚，而僅有26%顯示平衡的多系貢獻。
圖1 譜系限制性干細胞對人類造血的穩定克隆貢獻
為了探究這些譜系限制模式是否由CH驅動突變引起，研究人員進行了系統發育分析。通過單細胞衍生克隆的全基因組測序（WGS），他們重建了系統發育樹，發現PEM限制的克隆早在數十年前就已經確立其命運決定，且這些模式在不同CH驅動突變（如DNMT3A、TET2、ASXL1等）中廣泛分布，表明譜系限制并非主要由特定驅動突變決定。
特別有趣的是，研究發現DNMT3A突變的HSC克隆顯著富集于PEMBT模式，這可能是因為這些克隆通常在生命早期出現，當時HSC仍能主動補充長壽的T細胞。而隨著衰老，HSC逐漸失去T細胞再生能力，從而更多表現為PEMB或PEM模式。
為了確認B細胞貢獻是否反映持續的B淋巴細胞生成而非長壽B細胞的持久存在，研究人員檢測了克隆來源的CD34+CD19+B祖細胞（pro-B細胞）。結果顯示，在有成熟B細胞貢獻的HSC克隆中，pro-B細胞也存在相似的突變細胞分數（MCF），證明這是持續的B淋巴細胞生成過程。
更重要的是，移植實驗證實了譜系限制是HSC內在編程的特性。將來自同一供體的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到免疫缺陷NSG小鼠后，它們保持了與在人體內相同的譜系貢獻模式——能夠貢獻B細胞的克隆在小鼠中仍產生B細胞，而不能貢獻B細胞的克隆在小鼠中也無法產生B細胞。
前瞻性分析顯示，這些HSC克隆的譜系貢獻模式在長達65個月的觀察期內保持驚人穩定，無論是平衡的多系貢獻還是譜系限制/偏倚的模式，都未隨時間發生顯著變化。
系統發育分析揭示了HSC克隆譜系貢獻的兩種演變模式："等級"模式，即后代亞克隆比祖先克隆表現出更高程度的譜系限制（從PEMBT向PEMB或PEMB向PEM演變）；和更常見的"穩定"模式，即盡管與祖先克隆分離數十年，后代克隆仍顯示出高度一致的譜系貢獻模式。
本研究首次在人類中全面描繪了HSC克隆在穩態造血中的譜系貢獻模式，揭示了HSC存在穩定的內在譜系限制程序。這一發現不僅深化了對人類造血發育和衰老的理解，也為血液系統疾病的起源和治療提供了重要啟示。特別是這些譜系限制的HSC可能作為基因組改變的儲存庫，是不同譜系歸屬血液系統惡性腫瘤的起源細胞。
研究采用的幾個關鍵技術方法包括：1）通過錯誤校正靶向測序（ECTS）技術篩查骨髓樣本中的CH突變；2）利用流式細胞術分選純化HSC、各譜系祖細胞和成熟血細胞；3）采用微滴數字PCR（ddPCR）進行高靈敏度突變定量檢測；4）對單細胞衍生克隆進行全基因組測序（WGS）并重建系統發育樹；5）通過免疫缺陷NSG小鼠移植模型驗證HSC的譜系貢獻能力。
A limited repertoire of HSC lineage replenishment patterns
研究人員通過追蹤57個HSC來源克隆的譜系貢獻，發現人類HSC僅表現出三種穩定的譜系貢獻模式：PEMBT（平衡貢獻所有五系）、PEMB（貢獻髓系但不貢獻T細胞）和PEM（僅貢獻髓系）。這些模式在不同CH驅動突變中廣泛分布，表明譜系限制并非主要由特定驅動突變決定。
Phylogenetic analysis infers stable HSC lineage replenishment
系統發育分析顯示，PEM限制的克隆早在數十年前就已經確立其命運決定。研究發現HSC克隆的譜系貢獻模式在系統發育樹中保持穩定，后代亞克隆即使經過數十年進化，仍保持與祖先克隆高度一致的譜系貢獻模式。
HSC clonal lineage restriction is intrinsically programmed
移植實驗證實譜系限制是HSC內在編程的特性。將來自同一供體的PEMB限制和PEM限制的HSC克隆移植到NSG小鼠后，它們保持了與在人體內相同的譜系貢獻模式，證明這種限制不是由骨髓微環境等外在因素決定的。
Prospective analysis reveals stable HSC lineage replenishment
前瞻性分析顯示，22個HSC克隆家族的譜系貢獻模式在長達65個月的觀察期內保持穩定，無論是平衡的多系貢獻還是譜系限制/偏倚的模式都未隨時間發生顯著變化，證明了HSC克隆命運決定的長期穩定性。
圖2 追溯長效造血干細胞克隆的起源
該研究得出結論，人類HSC在穩態造血中表現出穩定且可預測的譜系貢獻模式，這些模式由HSC內在程序決定，并在數十年間保持穩定。除了能夠貢獻全部五系血細胞的多能HSC外，還存在譜系限制性的HSC群體，包括PEMB限制（貢獻髓系但不貢獻T細胞）和PEM限制（僅貢獻髓系）的HSC克隆。這些譜系限制模式并非主要由CH驅動突變引起，而是反映了HSC固有的分化程序。
這一發現對理解造血生物學具有重要意義：首先，它揭示了人類HSC在穩態造血中的功能異質性，挑戰了傳統認為所有HSC都具有同等多能性的觀點；其次，研究發現HSC的譜系貢獻模式在數十年間保持穩定，說明HSC的分化命運是預先編程的且具有長期記憶性；最后，這些譜系限制的HSC可能成為特定血液系統疾病的細胞起源，為預防和治療年齡相關血液疾病提供了新的思路。
研究還發現，隨著衰老進程，能夠貢獻全部五系（包括T細胞）的HSC克隆逐漸減少，而譜系限制的HSC克隆增加，這可能是造血系統衰老的重要機制之一。值得注意的是，DNMT3A突變的HSC克隆更傾向于保持多系分化能力，這可能與它們通常在生命早期出現有關，當時HSC仍能主動補充長壽的T細胞池。
這些發現將促使科學界重新思考HSC的功能異質性及其在健康和疾病中的作用，為靶向特定HSC群體的治療策略奠定基礎。
參考資料
[1] Stable clonal contribution of lineage-restricted stem cells to human hematopoiesis
