摘要：本研究首次系統(tǒng)揭示了由CASP8基因GGGAGA重復(fù)擴(kuò)展驅(qū)動的多聚甘氨酸-精氨酸（polyGR）蛋白聚集物在AD腦組織中的高頻存在。
阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）作為最常見的癡呆類型，其經(jīng)典病理特征包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊和tau蛋白過度磷酸化（pTau）形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。然而，約95%的散發(fā)性晚發(fā)性AD（LOAD）病例的分子驅(qū)動機(jī)制仍不明確。近年來，除Aβ和tau外，其他蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象（如TDP-43、α-突觸核蛋白）也被發(fā)現(xiàn)與AD病理共存，提示AD具有復(fù)雜的多蛋白質(zhì)opathy特征。在此背景下，研究者將目光投向一類新型病理聚集物——多聚甘氨酸-精氨酸（polyGR）蛋白。此前研究已知，在C9orf72基因突變相關(guān)的肌萎縮側(cè)索硬化/額顳葉癡呆（C9-ALS/FTD）中，polyGR可通過重復(fù)關(guān)聯(lián)非AUG翻譯（RAN translation）產(chǎn)生并具有強(qiáng)神經(jīng)毒性。但polyGR是否在AD中廣泛存在及其與AD典型病理的關(guān)聯(lián)尚屬未知。
為回答這一問題，研究團(tuán)隊整合來自美國佛羅里達(dá)AD研究中心、約翰霍普金斯大學(xué)和明尼蘇達(dá)大學(xué)腦庫的195例尸腦樣本（含156例AD、26例年齡匹配對照和13例原發(fā)性年齡相關(guān)tauopathy（PART）病例），通過免疫組化（IHC）、Western blot、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及氧化應(yīng)激模型等多技術(shù)手段，系統(tǒng)性探索了polyGR+聚集物的病理意義。
圖1 含有PolyGR的蛋白聚集物與阿爾茨海默病的病理及臨床表現(xiàn)相關(guān)
關(guān)鍵技術(shù)方法概述
研究主要依托以下方法展開：
1.1. 多中心尸腦隊列設(shè)計：涵蓋3個獨立AD隊列的海馬組織切片，確保結(jié)果可重復(fù)性。
2.2. 免疫組化與定量分析：采用特異性polyGR抗體（H3148）及Aβ（Ab5）、pTau（AT8）抗體染色，通過QuPath軟件進(jìn)行全切片定量。
3.3. 分子生物學(xué)實驗：構(gòu)建CASP8-GGGAGAEXP迷你基因載體（p-AD-R1、p-C-Var），轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，模擬polyGR表達(dá)及tau磷酸化過程。
4.4. 氧化應(yīng)激干預(yù)：使用H2O2處理細(xì)胞，觀察polyGR蛋白水平及pTau積累變化。
5.5. 基因分型與病理關(guān)聯(lián)分析：對APOE、TREM2等9個AD風(fēng)險SNPs進(jìn)行基因分型，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)（如卒中、高血壓史）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)檢驗。
研究結(jié)果
1. polyGR+聚集物在AD海馬體中高頻出現(xiàn)且具有特定分布模式
在三隊列中，約60%的AD腦樣本海馬區(qū)（CA、齒狀回、下托）檢測到polyGR+聚集信號，而對照和PART病例均無此現(xiàn)象。聚集形態(tài)可分為四類：胞質(zhì)彌漫型（88%）、核點狀（4%）、齒狀回特異性（24%）以及簇狀點狀（59%）。其中，簇狀點狀聚集與營養(yǎng)不良神經(jīng)突標(biāo)記物（如LAMP1）共定位，且該類AD患者發(fā)病年齡更早（68.5歲 vs 76歲）、死亡年齡更低（78歲 vs 81歲），提示其特殊毒性。
2. polyGR+聚集水平與AD神經(jīng)病理改變（ADNC）嚴(yán)重程度正相關(guān)
PolyGR+面積與Aβ斑塊（r=0.568）和pTau（r=0.538）負(fù)荷顯著相關(guān)。高polyGR組（閾值：海馬區(qū)面積占比≥0.00010371）的Aβ和pTau水平分別為低組的1.76倍和2.76倍。此外，Thal V期（Aβ廣泛擴(kuò)散）及Braak V-VI期（tau廣泛纏結(jié)）的AD腦polyGR信號更強(qiáng)，且CERAD評分“頻繁”的神經(jīng)炎斑組polyGR水平顯著高于無斑組。
3. polyGR+聚集與共存病理（LATE-NC、LBP）無整體關(guān)聯(lián)但可共定位
盡管海馬polyGR總量在LATE-NC（TDP-43病理）或路易體病理（LBP）陽性/陰性組間無差異，但雙標(biāo)染色顯示部分神經(jīng)元中polyGR與pTDP-43或α-突觸核蛋白包涵體共存，提示局部相互作用可能性。
4. AD風(fēng)險基因與非遺傳因素影響polyGR積累
在LOAD病例中，APOE4等位基因攜帶者海馬polyGR信號升高約2.5倍；一例TREM2風(fēng)險變異攜帶者亦呈現(xiàn)高polyGR水平。此外，有卒中史或高血壓（HBP）的LOAD患者polyGR水平分別為無腦損傷史組的3.8倍和3.71倍，而Aβ/pTau未同步升高，提示polyGR可能獨立響應(yīng)血管性應(yīng)激。
5. 氧化應(yīng)激直接促進(jìn)CASP8來源polyGR表達(dá)并加劇tau磷酸化
在SH-SY5Y模型中，H2O2處理使CASP8-GGGAGAEXP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的polyGR蛋白量增加27%，并進(jìn)一步使polyGR誘導(dǎo)的pTau（S202/T205）水平升高51%，而空載體對照組無此效應(yīng)。這表明氧化應(yīng)激可特異性放大CASP8重復(fù)擴(kuò)展的分子毒性。
圖2 在多組阿爾茨海默病尸檢腦樣本中，海馬體頻繁檢測到PolyGR+?蛋白聚集物
結(jié)論與意義
本研究首次在多中心AD隊列中證實polyGR+聚集是一種頻繁且未被充分認(rèn)識的蛋白質(zhì)opathy，其水平與AD核心病理（Aβ、pTau）嚴(yán)重程度及疾病進(jìn)展指標(biāo)（如早發(fā)、生存期縮短）緊密關(guān)聯(lián)。更重要的是，研究揭示了polyGR積累受遺傳（APOE4）和非遺傳風(fēng)險因素（卒中、高血壓）調(diào)控，并通過細(xì)胞實驗證明氧化應(yīng)激可直接增強(qiáng)CASP8來源polyGR的表達(dá)及tau病理。這些發(fā)現(xiàn)不僅將AD與RAN翻譯病理機(jī)制聯(lián)系起來，還為理解血管性風(fēng)險因素如何通過蛋白質(zhì)聚集途徑推動AD發(fā)病提供了新范式。未來針對polyGR產(chǎn)生通路（如CASP8重復(fù)擴(kuò)展、整合應(yīng)激反應(yīng)）的干預(yù)可能成為AD治療的新策略。
參考資料
[1] Genome-scale CRISPR screens identify PTGES3 as a direct modulator of androgen receptor function in advanced prostate cancer
摘要：本研究首次系統(tǒng)揭示了由CASP8基因GGGAGA重復(fù)擴(kuò)展驅(qū)動的多聚甘氨酸-精氨酸（polyGR）蛋白聚集物在AD腦組織中的高頻存在。
阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）作為最常見的癡呆類型，其經(jīng)典病理特征包括β-淀粉樣蛋白（Aβ）斑塊和tau蛋白過度磷酸化（pTau）形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。然而，約95%的散發(fā)性晚發(fā)性AD（LOAD）病例的分子驅(qū)動機(jī)制仍不明確。近年來，除Aβ和tau外，其他蛋白質(zhì)聚集現(xiàn)象（如TDP-43、α-突觸核蛋白）也被發(fā)現(xiàn)與AD病理共存，提示AD具有復(fù)雜的多蛋白質(zhì)opathy特征。在此背景下，研究者將目光投向一類新型病理聚集物——多聚甘氨酸-精氨酸（polyGR）蛋白。此前研究已知，在C9orf72基因突變相關(guān)的肌萎縮側(cè)索硬化/額顳葉癡呆（C9-ALS/FTD）中，polyGR可通過重復(fù)關(guān)聯(lián)非AUG翻譯（RAN translation）產(chǎn)生并具有強(qiáng)神經(jīng)毒性。但polyGR是否在AD中廣泛存在及其與AD典型病理的關(guān)聯(lián)尚屬未知。
為回答這一問題，研究團(tuán)隊整合來自美國佛羅里達(dá)AD研究中心、約翰霍普金斯大學(xué)和明尼蘇達(dá)大學(xué)腦庫的195例尸腦樣本（含156例AD、26例年齡匹配對照和13例原發(fā)性年齡相關(guān)tauopathy（PART）病例），通過免疫組化（IHC）、Western blot、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及氧化應(yīng)激模型等多技術(shù)手段，系統(tǒng)性探索了polyGR+聚集物的病理意義。
圖1 含有PolyGR的蛋白聚集物與阿爾茨海默病的病理及臨床表現(xiàn)相關(guān)
關(guān)鍵技術(shù)方法概述
研究主要依托以下方法展開：
1.1. 多中心尸腦隊列設(shè)計：涵蓋3個獨立AD隊列的海馬組織切片，確保結(jié)果可重復(fù)性。
2.2. 免疫組化與定量分析：采用特異性polyGR抗體（H3148）及Aβ（Ab5）、pTau（AT8）抗體染色，通過QuPath軟件進(jìn)行全切片定量。
3.3. 分子生物學(xué)實驗：構(gòu)建CASP8-GGGAGAEXP迷你基因載體（p-AD-R1、p-C-Var），轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，模擬polyGR表達(dá)及tau磷酸化過程。
4.4. 氧化應(yīng)激干預(yù)：使用H2O2處理細(xì)胞，觀察polyGR蛋白水平及pTau積累變化。
5.5. 基因分型與病理關(guān)聯(lián)分析：對APOE、TREM2等9個AD風(fēng)險SNPs進(jìn)行基因分型，并結(jié)合臨床數(shù)據(jù)（如卒中、高血壓史）進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)檢驗。
研究結(jié)果
1. polyGR+聚集物在AD海馬體中高頻出現(xiàn)且具有特定分布模式
在三隊列中，約60%的AD腦樣本海馬區(qū)（CA、齒狀回、下托）檢測到polyGR+聚集信號，而對照和PART病例均無此現(xiàn)象。聚集形態(tài)可分為四類：胞質(zhì)彌漫型（88%）、核點狀（4%）、齒狀回特異性（24%）以及簇狀點狀（59%）。其中，簇狀點狀聚集與營養(yǎng)不良神經(jīng)突標(biāo)記物（如LAMP1）共定位，且該類AD患者發(fā)病年齡更早（68.5歲 vs 76歲）、死亡年齡更低（78歲 vs 81歲），提示其特殊毒性。
2. polyGR+聚集水平與AD神經(jīng)病理改變（ADNC）嚴(yán)重程度正相關(guān)
PolyGR+面積與Aβ斑塊（r=0.568）和pTau（r=0.538）負(fù)荷顯著相關(guān)。高polyGR組（閾值：海馬區(qū)面積占比≥0.00010371）的Aβ和pTau水平分別為低組的1.76倍和2.76倍。此外，Thal V期（Aβ廣泛擴(kuò)散）及Braak V-VI期（tau廣泛纏結(jié)）的AD腦polyGR信號更強(qiáng)，且CERAD評分“頻繁”的神經(jīng)炎斑組polyGR水平顯著高于無斑組。
3. polyGR+聚集與共存病理（LATE-NC、LBP）無整體關(guān)聯(lián)但可共定位
盡管海馬polyGR總量在LATE-NC（TDP-43病理）或路易體病理（LBP）陽性/陰性組間無差異，但雙標(biāo)染色顯示部分神經(jīng)元中polyGR與pTDP-43或α-突觸核蛋白包涵體共存，提示局部相互作用可能性。
4. AD風(fēng)險基因與非遺傳因素影響polyGR積累
在LOAD病例中，APOE4等位基因攜帶者海馬polyGR信號升高約2.5倍；一例TREM2風(fēng)險變異攜帶者亦呈現(xiàn)高polyGR水平。此外，有卒中史或高血壓（HBP）的LOAD患者polyGR水平分別為無腦損傷史組的3.8倍和3.71倍，而Aβ/pTau未同步升高，提示polyGR可能獨立響應(yīng)血管性應(yīng)激。
5. 氧化應(yīng)激直接促進(jìn)CASP8來源polyGR表達(dá)并加劇tau磷酸化
在SH-SY5Y模型中，H2O2處理使CASP8-GGGAGAEXP轉(zhuǎn)染細(xì)胞的polyGR蛋白量增加27%，并進(jìn)一步使polyGR誘導(dǎo)的pTau（S202/T205）水平升高51%，而空載體對照組無此效應(yīng)。這表明氧化應(yīng)激可特異性放大CASP8重復(fù)擴(kuò)展的分子毒性。
圖2 在多組阿爾茨海默病尸檢腦樣本中，海馬體頻繁檢測到PolyGR+?蛋白聚集物
結(jié)論與意義
本研究首次在多中心AD隊列中證實polyGR+聚集是一種頻繁且未被充分認(rèn)識的蛋白質(zhì)opathy，其水平與AD核心病理（Aβ、pTau）嚴(yán)重程度及疾病進(jìn)展指標(biāo)（如早發(fā)、生存期縮短）緊密關(guān)聯(lián)。更重要的是，研究揭示了polyGR積累受遺傳（APOE4）和非遺傳風(fēng)險因素（卒中、高血壓）調(diào)控，并通過細(xì)胞實驗證明氧化應(yīng)激可直接增強(qiáng)CASP8來源polyGR的表達(dá)及tau病理。這些發(fā)現(xiàn)不僅將AD與RAN翻譯病理機(jī)制聯(lián)系起來，還為理解血管性風(fēng)險因素如何通過蛋白質(zhì)聚集途徑推動AD發(fā)病提供了新范式。未來針對polyGR產(chǎn)生通路（如CASP8重復(fù)擴(kuò)展、整合應(yīng)激反應(yīng)）的干預(yù)可能成為AD治療的新策略。
參考資料
[1] Genome-scale CRISPR screens identify PTGES3 as a direct modulator of androgen receptor function in advanced prostate cancer
