摘要：本研究針對術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知障礙(PNCI)缺乏有效靶向治療的問題，開展了關(guān)于海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性及網(wǎng)絡(luò)通訊機制的單細(xì)胞測序研究。
隨著全球人口老齡化和外科技術(shù)的發(fā)展，接受手術(shù)治療的老年患者日益增多。然而，手術(shù)創(chuàng)傷和麻醉等因素使這一人群易患術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知障礙(PNCI)，這種并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者康復(fù)進(jìn)程和生活質(zhì)量。盡管PNCI具有重要的臨床意義，但其發(fā)病機制尚未完全闡明，且缺乏有效的靶向治療方法。海馬體作為學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，已被廣泛證實與術(shù)后認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。
研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥是PNCI發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵致病驅(qū)動因素。作為CNS的常駐免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)圍手術(shù)期炎癥和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用。然而，圍手術(shù)期小膠質(zhì)細(xì)胞在PNCI發(fā)生發(fā)展中的貢獻(xiàn)、表型異質(zhì)性和通訊網(wǎng)絡(luò)仍特征不足。傳統(tǒng)上將小膠質(zhì)細(xì)胞簡單分為M1(神經(jīng)毒性和促炎)和M2(神經(jīng)保護和抗炎)表型的二分法已不能完全捕捉小膠質(zhì)細(xì)胞表型異質(zhì)性的復(fù)雜性。在阿爾茨海默病(AD)模型中，特定小膠質(zhì)細(xì)胞亞群——疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAM)的特征已被描述，但在圍手術(shù)期海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞特定亞群的作用及其激活過程中的表型異質(zhì)性仍知之甚少。
圖1 炎癥相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞擴增會破壞海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的通信，進(jìn)而引發(fā)術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知功能障礙
為了解決這些知識空白，鄭玉祥等研究人員在《Journal of Neuroinflammation》上發(fā)表了題為"Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment"的研究論文。該研究通過單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)，系統(tǒng)描繪了PNCI小鼠海馬區(qū)膠質(zhì)和血管細(xì)胞的全景圖譜，特別聚焦于小膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性及其細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)。
研究人員為開展本研究主要采用了以下幾個關(guān)鍵技術(shù)方法：使用18月齡老年小鼠建立PNCI模型并開展行為學(xué)測試；對對照組和手術(shù)組小鼠海馬組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序分析；通過免疫熒光結(jié)合熒光原位雜交(IF/FISH)驗證亞群數(shù)量和靶RNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)；利用透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)；采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測海馬TNF-α水平；通過Morris水迷宮和恐懼條件測試評估認(rèn)知功能；應(yīng)用TNF抑制劑依那西普進(jìn)行干預(yù)研究。
研究人員對術(shù)后24小時的小鼠海馬組織進(jìn)行scRNA-seq分析，共獲得20,684個海馬細(xì)胞，鑒定出10種細(xì)胞群，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、神經(jīng)元等。聚焦于血腦屏障損傷、CNS炎癥和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有重要生物學(xué)功能的兩種膠質(zhì)細(xì)胞群和一種血管細(xì)胞群：小膠質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)記基因C1qc，對照組3,814個細(xì)胞，手術(shù)組4,776個細(xì)胞)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)記基因Aqp4，對照組1,183個細(xì)胞，手術(shù)組1,072個細(xì)胞)和內(nèi)皮細(xì)胞(標(biāo)記基因Flt1，對照組150個細(xì)胞，手術(shù)組236個細(xì)胞)。
對8,590個海馬小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行二次聚類分析，鑒定出八個轉(zhuǎn)錄不同的亞群：穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞(HM，占42%)、過渡狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞(TSM，占27%，表達(dá)即刻早期基因IEGs和炎癥基因)、炎癥相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(IAM，占12%，表達(dá)大量炎癥相關(guān)基因)、疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAM，占6%)以及三個具有抗炎和神經(jīng)保護基因表達(dá)模式的亞群：炎癥抑制性小膠質(zhì)細(xì)胞(IIM，占6%)、代謝相關(guān)抑制性小膠質(zhì)細(xì)胞(MIM，占2%)和疾病相關(guān)抑制性小膠質(zhì)細(xì)胞(DIM，占1%)，其余4%為巨噬細(xì)胞。
手術(shù)組與對照組相比，小膠質(zhì)細(xì)胞亞群發(fā)生顯著變化：HM從術(shù)前的81%降至9.8%(下降88%)；TSM從1.4%增至47.8%(增加超過33倍)；IAM從1.3%增至21%(增加超過14倍)。這些發(fā)現(xiàn)表明手術(shù)后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被深刻破壞，向過渡狀態(tài)和炎癥相關(guān)激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變。
偽時間分析顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞從HM開始，通過以即刻早期基因表達(dá)為特征的中間轉(zhuǎn)錄狀態(tài)(TSM)，隨后分化為兩個不同的分支：促炎(IAM)或抗炎(IIM)基因表達(dá)模式?；蚬脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)分析確定了HM、TSM、IAM和IIM這些亞群功能的關(guān)鍵調(diào)控基因。
基于圍手術(shù)期小膠質(zhì)細(xì)胞亞群的變化，建立了小膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān)信號通路。在IAM中，Tnf及其受體Tnfrsf1a均上調(diào)。促炎細(xì)胞因子Il1b通過TNF和NF-κB通路上調(diào)，導(dǎo)致促炎反應(yīng)。Ccl2和Tspo在IAM中上調(diào)，而Hk2和Prkcd在DAM中升高。IF/FISH雙染證實手術(shù)組海馬中Tnf+IBA1+細(xì)胞(IAM)顯著增加。作為IAM的炎癥標(biāo)記基因，Tnf、Tnfrsf1a和Il1b mRNA的熒光強度在手術(shù)組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著升高。作為IAM的趨化因子和線粒體標(biāo)記基因，Ccl2和Tspo mRNA的熒光強度也在海馬小膠質(zhì)細(xì)胞中升高。
聚類分析鑒定出六個不同的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群：穩(wěn)態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞(HA，占36%)、血管生成相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞(AAA，占3%)、代謝相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞(MAA，占4%)、疾病和代謝相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞(DMA，占32%)、疾病相關(guān)抑制性星形膠質(zhì)細(xì)胞(DIA，占9%)和代謝相關(guān)抑制性星形膠質(zhì)細(xì)胞(MIA，占16%)。與微膠質(zhì)細(xì)胞相比，圍手術(shù)期星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化不太明顯：手術(shù)組HA從術(shù)前39.6%降至32.6%(下降17.5%)，MIA從14.1%增至17.9%(增加26.9%)，其他亞群變化更不顯著。
CellChat分析顯示，手術(shù)后細(xì)胞間通訊增加，小膠質(zhì)細(xì)胞到小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞到星形膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞到小膠質(zhì)細(xì)胞的信號顯著增強。在小膠質(zhì)細(xì)胞亞群中，IAM和TSM表現(xiàn)出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(shù)(IAM=91，TSM=85)和相互作用強度(均為2.7)。在星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中，HA和MAA表現(xiàn)出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(shù)(HA=135，MAA=111)和強度(HA=4.4，MAA=4.6)。隨后的IAM亞群分析顯示，在所有差異通路中，TNF信號在傳入和傳出相互作用強度方面增加最大。
對微膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)的主要信號通路進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在TNF信號通路中，手術(shù)后IAM成為TNF信號的主要調(diào)節(jié)因子，作為TNF配體的主要來源、TNF相關(guān)信號的主要接收者和信號傳播中的關(guān)鍵中介。Tnf-Tnfrsf1a配體-受體(L-R)對通訊在手術(shù)組IAM中顯著增加。在BAFF通路中，手術(shù)后IAM通過同時產(chǎn)生BAFF配體、響應(yīng)BAFF相關(guān)線索和參與微膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的信號中繼顯示出增強的參與。在CHEMERIN通路中，激活的IAM成為星形膠質(zhì)細(xì)胞源性CHEMERIN信號的主要接收者。在APP通路中，內(nèi)皮細(xì)胞作為APP相關(guān)信號的主要來源，主要靶向DIM。
基于已識別的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群和細(xì)胞間通訊模式，建立了假設(shè)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，顯示IAM通過升高的TNF信號在啟動炎癥中起關(guān)鍵作用，從而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙。透射電子顯微鏡顯示手術(shù)后海馬血管超微結(jié)構(gòu)變化：內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的 cytoplasmic vacuolization 和基底膜碎片化，表明內(nèi)皮屏障損傷。
選擇臨床可用的TNF抑制劑依那西普(etanercept)靶向IAM驅(qū)動的炎癥。ELISA證實海馬TNF-α水平在手術(shù)組顯著增加，依那西普治療后有效抑制。IF/FISH驗證了調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)主要功能基因的表達(dá)：炎癥基因Tnf、Ccl2和Il1b在手術(shù)組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)，而TNF抑制劑將其表達(dá)降低至基線水平。免疫熒光證實TNF-α蛋白表達(dá)也在手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞中增加，TNF抑制劑將其表達(dá)降低至基線。Egr1和C1qa在星形膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)，Icam1和Iftm3在手術(shù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)，TNF抑制劑將其表達(dá)降低至基線。
通過Morris水迷宮(MWM)和恐懼條件測試(FCT)評估老年小鼠手術(shù)后和TNF抑制后的認(rèn)知功能。在MWM測試中，逃避潛伏期在對照組隨著訓(xùn)練進(jìn)行顯著減少，這種趨勢在手術(shù)組不太明顯，TNF抑制劑治療可挽救這種缺陷。空間記憶通過平臺穿越次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間評估，手術(shù)后受損，TNF抑制劑治療可挽救。在FCT中，海馬依賴的情景記憶在手術(shù)后1天和5天顯著受損，TNF抑制劑治療挽救了這些情境認(rèn)知障礙。對于海馬非依賴的語調(diào)認(rèn)知，兩組方差分析顯示治療(依那西普vs鹽水)和條件(對照vs手術(shù))之間沒有顯著交互作用。
圖2 對照組和手術(shù)組小鼠的海馬體均于術(shù)后24小時提取，用于單細(xì)胞RNA測序分析
本研究提供了PNCI小鼠海馬膠質(zhì)和血管細(xì)胞群的單細(xì)胞圖譜，揭示了八個微膠質(zhì)細(xì)胞亞群。其中，擴增的IAM表現(xiàn)出與膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增強的網(wǎng)絡(luò)通訊，通過TNF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)促進(jìn)海馬炎癥。此外，TNF抑制減輕了術(shù)后微膠質(zhì)細(xì)胞激活和認(rèn)知障礙。這些發(fā)現(xiàn)突出了海馬IAM作為PNCI預(yù)防和治療的關(guān)鍵致病驅(qū)動因素和有前景的治療靶點。
該研究的創(chuàng)新之處在于首次在圍手術(shù)期背景下系統(tǒng)描繪了海馬區(qū)微膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性圖譜，特別是發(fā)現(xiàn)了IAM這一關(guān)鍵亞群在PNCI中的核心作用。不同于神經(jīng)退行性疾病中觀察到的慢性激活，圍手術(shù)期微膠質(zhì)細(xì)胞激活是短暫而強烈的，術(shù)后24小時即觀察到IAM增加。這種急性微膠質(zhì)細(xì)胞激活可能啟動長期的神經(jīng)炎癥和進(jìn)行性神經(jīng)元功能障礙，導(dǎo)致長期認(rèn)知障礙。
研究還揭示了微膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成膠質(zhì)血管單元(GVU)，在神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展中調(diào)節(jié)血腦屏障功能和CNS穩(wěn)態(tài)中起著不可或缺的作用。在GVU內(nèi)，微膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦血管保持密切的空間接近。研究表明，術(shù)后IAM的擴增與星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的通訊增強相關(guān)。IAM誘導(dǎo)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞表型，進(jìn)一步塑造炎癥微環(huán)境。微膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的雙向相互作用，以及內(nèi)皮功能障礙，形成維持神經(jīng)炎癥的病理循環(huán)。
該研究為PNCI的防治提供了新的思路和靶點。控制微膠質(zhì)細(xì)胞激活和減輕CNS炎癥已被確定為AD、缺血性中風(fēng)和創(chuàng)傷性腦損傷的有前景的治療策略。研究表明，靶向IAM通過TNF信號干預(yù)具有治療潛力。臨床試驗也顯示TNF抑制劑在AD患者中的安全性、耐受性和潛在認(rèn)知益處。然而，這種干預(yù)仍然是超適應(yīng)癥使用，TNF抑制劑在PNCI和神經(jīng)退行性疾病患者中的使用仍需進(jìn)一步研究。
總之，這項研究不僅深化了對PNCI發(fā)病機制的理解，而且為開發(fā)針對特定微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的精準(zhǔn)治療策略提供了重要依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床轉(zhuǎn)化價值。
參考資料
[1] Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment
摘要：本研究針對術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知障礙(PNCI)缺乏有效靶向治療的問題，開展了關(guān)于海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞異質(zhì)性及網(wǎng)絡(luò)通訊機制的單細(xì)胞測序研究。
隨著全球人口老齡化和外科技術(shù)的發(fā)展，接受手術(shù)治療的老年患者日益增多。然而，手術(shù)創(chuàng)傷和麻醉等因素使這一人群易患術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知障礙(PNCI)，這種并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者康復(fù)進(jìn)程和生活質(zhì)量。盡管PNCI具有重要的臨床意義，但其發(fā)病機制尚未完全闡明，且缺乏有效的靶向治療方法。海馬體作為學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，已被廣泛證實與術(shù)后認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)。
研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎癥是PNCI發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵致病驅(qū)動因素。作為CNS的常駐免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在調(diào)節(jié)圍手術(shù)期炎癥和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用。然而，圍手術(shù)期小膠質(zhì)細(xì)胞在PNCI發(fā)生發(fā)展中的貢獻(xiàn)、表型異質(zhì)性和通訊網(wǎng)絡(luò)仍特征不足。傳統(tǒng)上將小膠質(zhì)細(xì)胞簡單分為M1(神經(jīng)毒性和促炎)和M2(神經(jīng)保護和抗炎)表型的二分法已不能完全捕捉小膠質(zhì)細(xì)胞表型異質(zhì)性的復(fù)雜性。在阿爾茨海默病(AD)模型中，特定小膠質(zhì)細(xì)胞亞群——疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAM)的特征已被描述，但在圍手術(shù)期海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞特定亞群的作用及其激活過程中的表型異質(zhì)性仍知之甚少。
圖1 炎癥相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞擴增會破壞海馬區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)的通信，進(jìn)而引發(fā)術(shù)后神經(jīng)認(rèn)知功能障礙
為了解決這些知識空白，鄭玉祥等研究人員在《Journal of Neuroinflammation》上發(fā)表了題為"Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment"的研究論文。該研究通過單細(xì)胞RNA測序(scRNA-seq)技術(shù)，系統(tǒng)描繪了PNCI小鼠海馬區(qū)膠質(zhì)和血管細(xì)胞的全景圖譜，特別聚焦于小膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性及其細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)。
研究人員為開展本研究主要采用了以下幾個關(guān)鍵技術(shù)方法：使用18月齡老年小鼠建立PNCI模型并開展行為學(xué)測試；對對照組和手術(shù)組小鼠海馬組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測序分析；通過免疫熒光結(jié)合熒光原位雜交(IF/FISH)驗證亞群數(shù)量和靶RNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá)；利用透射電子顯微鏡觀察血腦屏障超微結(jié)構(gòu)；采用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測海馬TNF-α水平；通過Morris水迷宮和恐懼條件測試評估認(rèn)知功能；應(yīng)用TNF抑制劑依那西普進(jìn)行干預(yù)研究。
研究人員對術(shù)后24小時的小鼠海馬組織進(jìn)行scRNA-seq分析，共獲得20,684個海馬細(xì)胞，鑒定出10種細(xì)胞群，包括小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)、神經(jīng)元等。聚焦于血腦屏障損傷、CNS炎癥和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中具有重要生物學(xué)功能的兩種膠質(zhì)細(xì)胞群和一種血管細(xì)胞群：小膠質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)記基因C1qc，對照組3,814個細(xì)胞，手術(shù)組4,776個細(xì)胞)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(標(biāo)記基因Aqp4，對照組1,183個細(xì)胞，手術(shù)組1,072個細(xì)胞)和內(nèi)皮細(xì)胞(標(biāo)記基因Flt1，對照組150個細(xì)胞，手術(shù)組236個細(xì)胞)。
對8,590個海馬小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行二次聚類分析，鑒定出八個轉(zhuǎn)錄不同的亞群：穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞(HM，占42%)、過渡狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞(TSM，占27%，表達(dá)即刻早期基因IEGs和炎癥基因)、炎癥相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(IAM，占12%，表達(dá)大量炎癥相關(guān)基因)、疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞(DAM，占6%)以及三個具有抗炎和神經(jīng)保護基因表達(dá)模式的亞群：炎癥抑制性小膠質(zhì)細(xì)胞(IIM，占6%)、代謝相關(guān)抑制性小膠質(zhì)細(xì)胞(MIM，占2%)和疾病相關(guān)抑制性小膠質(zhì)細(xì)胞(DIM，占1%)，其余4%為巨噬細(xì)胞。
手術(shù)組與對照組相比，小膠質(zhì)細(xì)胞亞群發(fā)生顯著變化：HM從術(shù)前的81%降至9.8%(下降88%)；TSM從1.4%增至47.8%(增加超過33倍)；IAM從1.3%增至21%(增加超過14倍)。這些發(fā)現(xiàn)表明手術(shù)后海馬小膠質(zhì)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)被深刻破壞，向過渡狀態(tài)和炎癥相關(guān)激活狀態(tài)轉(zhuǎn)變。
偽時間分析顯示，小膠質(zhì)細(xì)胞從HM開始，通過以即刻早期基因表達(dá)為特征的中間轉(zhuǎn)錄狀態(tài)(TSM)，隨后分化為兩個不同的分支：促炎(IAM)或抗炎(IIM)基因表達(dá)模式?；蚬脖磉_(dá)網(wǎng)絡(luò)分析確定了HM、TSM、IAM和IIM這些亞群功能的關(guān)鍵調(diào)控基因。
基于圍手術(shù)期小膠質(zhì)細(xì)胞亞群的變化，建立了小膠質(zhì)細(xì)胞激活相關(guān)信號通路。在IAM中，Tnf及其受體Tnfrsf1a均上調(diào)。促炎細(xì)胞因子Il1b通過TNF和NF-κB通路上調(diào)，導(dǎo)致促炎反應(yīng)。Ccl2和Tspo在IAM中上調(diào)，而Hk2和Prkcd在DAM中升高。IF/FISH雙染證實手術(shù)組海馬中Tnf+IBA1+細(xì)胞(IAM)顯著增加。作為IAM的炎癥標(biāo)記基因，Tnf、Tnfrsf1a和Il1b mRNA的熒光強度在手術(shù)組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著升高。作為IAM的趨化因子和線粒體標(biāo)記基因，Ccl2和Tspo mRNA的熒光強度也在海馬小膠質(zhì)細(xì)胞中升高。
聚類分析鑒定出六個不同的星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群：穩(wěn)態(tài)星形膠質(zhì)細(xì)胞(HA，占36%)、血管生成相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞(AAA，占3%)、代謝相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞(MAA，占4%)、疾病和代謝相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞(DMA，占32%)、疾病相關(guān)抑制性星形膠質(zhì)細(xì)胞(DIA，占9%)和代謝相關(guān)抑制性星形膠質(zhì)細(xì)胞(MIA，占16%)。與微膠質(zhì)細(xì)胞相比，圍手術(shù)期星形膠質(zhì)細(xì)胞的變化不太明顯：手術(shù)組HA從術(shù)前39.6%降至32.6%(下降17.5%)，MIA從14.1%增至17.9%(增加26.9%)，其他亞群變化更不顯著。
CellChat分析顯示，手術(shù)后細(xì)胞間通訊增加，小膠質(zhì)細(xì)胞到小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞到星形膠質(zhì)細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞到小膠質(zhì)細(xì)胞的信號顯著增強。在小膠質(zhì)細(xì)胞亞群中，IAM和TSM表現(xiàn)出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(shù)(IAM=91，TSM=85)和相互作用強度(均為2.7)。在星形膠質(zhì)細(xì)胞亞群中，HA和MAA表現(xiàn)出最高的總差異傳出和傳入相互作用數(shù)(HA=135，MAA=111)和強度(HA=4.4，MAA=4.6)。隨后的IAM亞群分析顯示，在所有差異通路中，TNF信號在傳入和傳出相互作用強度方面增加最大。
對微膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)的主要信號通路進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在TNF信號通路中，手術(shù)后IAM成為TNF信號的主要調(diào)節(jié)因子，作為TNF配體的主要來源、TNF相關(guān)信號的主要接收者和信號傳播中的關(guān)鍵中介。Tnf-Tnfrsf1a配體-受體(L-R)對通訊在手術(shù)組IAM中顯著增加。在BAFF通路中，手術(shù)后IAM通過同時產(chǎn)生BAFF配體、響應(yīng)BAFF相關(guān)線索和參與微膠質(zhì)網(wǎng)絡(luò)中的信號中繼顯示出增強的參與。在CHEMERIN通路中，激活的IAM成為星形膠質(zhì)細(xì)胞源性CHEMERIN信號的主要接收者。在APP通路中，內(nèi)皮細(xì)胞作為APP相關(guān)信號的主要來源，主要靶向DIM。
基于已識別的微膠質(zhì)細(xì)胞亞群和細(xì)胞間通訊模式，建立了假設(shè)的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，顯示IAM通過升高的TNF信號在啟動炎癥中起關(guān)鍵作用，從而影響星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)和內(nèi)皮功能障礙。透射電子顯微鏡顯示手術(shù)后海馬血管超微結(jié)構(gòu)變化：內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)明顯的 cytoplasmic vacuolization 和基底膜碎片化，表明內(nèi)皮屏障損傷。
選擇臨床可用的TNF抑制劑依那西普(etanercept)靶向IAM驅(qū)動的炎癥。ELISA證實海馬TNF-α水平在手術(shù)組顯著增加，依那西普治療后有效抑制。IF/FISH驗證了調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)主要功能基因的表達(dá)：炎癥基因Tnf、Ccl2和Il1b在手術(shù)組海馬小膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)，而TNF抑制劑將其表達(dá)降低至基線水平。免疫熒光證實TNF-α蛋白表達(dá)也在手術(shù)組小膠質(zhì)細(xì)胞中增加，TNF抑制劑將其表達(dá)降低至基線。Egr1和C1qa在星形膠質(zhì)細(xì)胞中顯著上調(diào)，Icam1和Iftm3在手術(shù)組血管內(nèi)皮細(xì)胞中顯著上調(diào)，TNF抑制劑將其表達(dá)降低至基線。
通過Morris水迷宮(MWM)和恐懼條件測試(FCT)評估老年小鼠手術(shù)后和TNF抑制后的認(rèn)知功能。在MWM測試中，逃避潛伏期在對照組隨著訓(xùn)練進(jìn)行顯著減少，這種趨勢在手術(shù)組不太明顯，TNF抑制劑治療可挽救這種缺陷?？臻g記憶通過平臺穿越次數(shù)和在目標(biāo)象限停留時間評估，手術(shù)后受損，TNF抑制劑治療可挽救。在FCT中，海馬依賴的情景記憶在手術(shù)后1天和5天顯著受損，TNF抑制劑治療挽救了這些情境認(rèn)知障礙。對于海馬非依賴的語調(diào)認(rèn)知，兩組方差分析顯示治療(依那西普vs鹽水)和條件(對照vs手術(shù))之間沒有顯著交互作用。
圖2 對照組和手術(shù)組小鼠的海馬體均于術(shù)后24小時提取，用于單細(xì)胞RNA測序分析
本研究提供了PNCI小鼠海馬膠質(zhì)和血管細(xì)胞群的單細(xì)胞圖譜，揭示了八個微膠質(zhì)細(xì)胞亞群。其中，擴增的IAM表現(xiàn)出與膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增強的網(wǎng)絡(luò)通訊，通過TNF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)促進(jìn)海馬炎癥。此外，TNF抑制減輕了術(shù)后微膠質(zhì)細(xì)胞激活和認(rèn)知障礙。這些發(fā)現(xiàn)突出了海馬IAM作為PNCI預(yù)防和治療的關(guān)鍵致病驅(qū)動因素和有前景的治療靶點。
該研究的創(chuàng)新之處在于首次在圍手術(shù)期背景下系統(tǒng)描繪了海馬區(qū)微膠質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性圖譜，特別是發(fā)現(xiàn)了IAM這一關(guān)鍵亞群在PNCI中的核心作用。不同于神經(jīng)退行性疾病中觀察到的慢性激活，圍手術(shù)期微膠質(zhì)細(xì)胞激活是短暫而強烈的，術(shù)后24小時即觀察到IAM增加。這種急性微膠質(zhì)細(xì)胞激活可能啟動長期的神經(jīng)炎癥和進(jìn)行性神經(jīng)元功能障礙，導(dǎo)致長期認(rèn)知障礙。
研究還揭示了微膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成膠質(zhì)血管單元(GVU)，在神經(jīng)退行性疾病進(jìn)展中調(diào)節(jié)血腦屏障功能和CNS穩(wěn)態(tài)中起著不可或缺的作用。在GVU內(nèi)，微膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞與腦血管保持密切的空間接近。研究表明，術(shù)后IAM的擴增與星形膠質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的通訊增強相關(guān)。IAM誘導(dǎo)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞表型，進(jìn)一步塑造炎癥微環(huán)境。微膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的雙向相互作用，以及內(nèi)皮功能障礙，形成維持神經(jīng)炎癥的病理循環(huán)。
該研究為PNCI的防治提供了新的思路和靶點。控制微膠質(zhì)細(xì)胞激活和減輕CNS炎癥已被確定為AD、缺血性中風(fēng)和創(chuàng)傷性腦損傷的有前景的治療策略。研究表明，靶向IAM通過TNF信號干預(yù)具有治療潛力。臨床試驗也顯示TNF抑制劑在AD患者中的安全性、耐受性和潛在認(rèn)知益處。然而，這種干預(yù)仍然是超適應(yīng)癥使用，TNF抑制劑在PNCI和神經(jīng)退行性疾病患者中的使用仍需進(jìn)一步研究。
總之，這項研究不僅深化了對PNCI發(fā)病機制的理解，而且為開發(fā)針對特定微膠質(zhì)細(xì)胞亞群的精準(zhǔn)治療策略提供了重要依據(jù)，具有重要的理論意義和臨床轉(zhuǎn)化價值。
參考資料
[1] Inflammation associated microglial expansion disrupts hippocampal glial network communication, driving postoperative neurocognitive impairment
