1.項目背景    

摘自《總甲狀腺素檢測試劑注冊技術審查指導原則》

1.1甲狀腺素（T4）的介紹    

甲狀腺素（T4），即3,5,3',5'-四碘甲腺原氨酸，分子量約為776.93道爾頓，是甲狀腺腺體分泌的主要激素，以游離形式釋放進入血循環中，絕大多數（99%以上）與血漿中的蛋白質結合，稱為結合態，還有極微量的T4未與血漿中的蛋白質結合，稱為游離態。

雖然結合型的甲狀腺激素在血液中占了絕大多數，但真正發揮生理作用的仍然是游離的甲狀腺激素。它的主要功能有維持生長發育、促進代謝、產生神經系統及心血管效應、影響長骨的生長和腦的發育，是下丘腦-垂體-甲狀腺激素調節系統的組成部分，具有調節機體代謝的作用。

總甲狀腺素（TT4）指血清中游離態與結合態甲狀腺素總和，TT4的檢測在臨床上作為甲狀腺功能異常的輔助診斷，不作為甲狀腺癌的輔助診斷。

1.2 臨床意義    

1.2.1 TT4增高的臨床意義    

TT4升高見于：①甲狀腺功能亢進（包括原發性、繼發性甲亢以及自主功能結節、T4型甲亢）時，甲狀腺合成和分泌TT4增高；②新生兒一時性甲狀腺功能亢進；③亞急性甲狀腺炎和無痛性甲狀腺炎（如慢性淋巴細胞性甲狀腺炎）；④大量服用甲狀腺素和動物甲狀腺；⑤口服避孕藥、雌激素、肝炎、遺傳性TBG增高、吸毒等均能使TT4增高；⑥TSH不適當分泌綜合征時增高。

1.2.2 TT4降低的臨床意義    

TT4降低見于：①甲狀腺功能減低時，TT4減低；②甲狀腺缺乏，或先天性發育不良，甲狀腺全切除后，血TT4缺乏；③各種非甲狀腺疾病，如各種肝病、肝硬化、肝昏迷、腎病、腎衰、心肌梗死、呼吸及消化系統的嚴重疾病、傳染病、創傷、燒傷、饑餓、蛋白營養不良、糖尿病等，均可導致低T3綜合征，病情嚴重者TT4亦降低。若TT4顯著降低，提示病情危重預后不良。病情緩解后TT4恢復正常。

FT4 是一種未結合的具有生物活性的形式，在總T4中僅占0.03%。絕大部分T4無活性，與血清蛋白結合，如甲狀腺結合球蛋白(75%)，前白蛋白(15%)，白蛋白(10%)。游離T4的檢測理論上不受結合蛋白濃度和結合力特性的影響，因此不需要額外進行反映結合參數類項目的檢測(如T-uptake，TBG)。

因此游離甲狀腺素的測定是臨床常規診斷的重要指標。當懷疑甲狀腺功能紊亂時，常常

聯合檢測游離T4和TSH。FT4也適合于甲狀腺抑制治療的療效監測多種方法可測定游離甲狀腺素水平。平衡透析法和超濾法直接測定fT3和fT4是標化常規免疫檢測方法的參考測量程序，免疫程序一般用于常規診斷。

1.3小分子雙抗體夾心法    

2024年公開專利CN117871874A《小分子物質免疫檢測方法》對小分子夾心法的反應原理做了詳細闡述，摘抄部分內容如下。

本發明提出了一種小分子物質免疫檢測方法，其特征在于，包括：（1）將含有小分子物質的樣本、配體、第二抗體和表面活性劑進行反應，得到小分子物質-配體-第二抗體三元復合物，且所述小分子物質-配體-第二抗體三元復合物中小分子物質誘導配體形成至少一個新的構象表位，所述第二抗體可特異性結合所述至少一個新的構象表位，所述表面活性劑可消除所述第二抗體與構象未改變的配體之間的結合；（2）檢測所述小分子物質-配體-第二抗體三元復合物。

樣本中的小分子物質與配體發生特異性結合，得到小分子物質-配體復合物，并且小分子物質-配體復合物中小分子物質誘導配體形成至少一個新的構象表位。小分子物質-配體復合物與第二抗體和表面活性劑反應，第二抗體特異性地與形成新構象表位的配體結合，同時也會與構象未改變的配體產生弱結合。表面活性劑可消除第二抗體與構象未改變的配體之間的結合，得到小分子物質-配體-第二抗體三元復合物。通過檢測三元復合物，可以實現小分子物質檢測。由此，采用雙抗體夾心法可以提高檢測準確性和靈敏度，不同濃度梯度樣本檢測區分度高。同時，減少了篩選高特異性復合物抗體的難度，更有利于小分子物質檢測試劑盒的大規模生產和檢測，應用價值高。    

2. 性能表現    

針對TT4/FT4的檢測（夾心法），西寶生物推出2株抗體、1株抗原及1種解離劑。

具體性能如下（以下評估僅代表在西寶生物的工藝體系下的驗證，建議客戶根據自身工藝進行更為詳細的驗證）。

2.1化學發光（AE）平臺    

組合1（TT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標記吖啶酯+總甲狀腺激素（TT4)解離液（發光專用）（貨號：DCH0209A）；    

線性范圍：0.5ug/dL-25ug/dL；最低檢出限：0.5ug/dL。

   

組合1（FT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標記吖啶酯；    

線性范圍：0.1ng/dL-7ng/dL；最低檢出限：0.1ng/dL。

2.2化學發光（AP）平臺    

組合2（TT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4（貨號：EKY0325G）標記堿性磷酸酶+總甲狀腺激素（TT4)解離液（發光專用）（貨號：DCH0209A）；    

線性范圍：0.5ug/dL-25ug/dL；最低檢出限：0.5ug/dL。

   

組合2（FT4）：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被羧基磁珠+T4抗體（貨號：EKY0325G）標記堿性磷酸酶；    

線性范圍：0.1ng/dL-7ng/dL；最低檢出限：0.1ng/dL。

2.3穩定性評估    

2.3.1 各組分工作液穩定性    

采用Seebio品牌甲狀腺素（T4）結合物AE發光稀釋液（貨號：DCD0525A）分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標記T4抗體濃縮液配置成工作液及Seebio品牌甲狀腺素（T4）AP酶標記物稀釋液（貨號DCD0526A）將堿性磷酸酶標記T4抗體濃縮液配置成工作液，分別進行37℃熱穩定性實驗。如表1所示：

a.磁珠包被T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發光值平均變化在±10%以內（不含S0），表明磁珠包被T4抗體工作液熱穩定性良好；

b.吖啶酯標記T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發光值平均變化在±10%以內（不含S0），表明吖啶酯標記T4抗體工作液熱穩定性較好；

c.堿性磷酸酶標記T4抗體工作液單獨37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發光值平均變化在±20%以內（不含S0），表明堿性磷酸酶標記T4抗體工作液熱穩定性較好。

表1 T4各組分工作液熱穩定性7天數據    

2.3.2 T4標準品穩定性    

2.3.2.1 采用甲狀腺素（T4）標準品稀釋液1（貨號：DCD0527A）含復合酶保護劑AFP（ACE0074A）或復合酶穩定劑AES（ACE0070A）分別將T4標準品（貨號：DKY0346A）稀釋成5個梯度（液體型），進行37℃熱穩定性實驗。

a）T4標準品稀釋梯度（液體型）2-8℃熱加速7天與-20℃儲存7天發光值平均變化在±10%以內;

b）T4標準品稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與-20℃儲存7天發光值平均變化在±10%以內;

c）T4標準品抗原稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發光值平均變化在±10%以內;表明T4標準品在稀釋梯度（液體型）穩定性良好。

表2 T4標準品梯度（液體型）穩定性數據-T4標準品稀釋液1

2.3.2.2 采用甲狀腺素（T4）標準品稀釋液2（貨號：DCD0527B）含復合酶保護劑AFP（ACE0074A）或蛋白保護劑AEP-HBC（ACL0012A）或復合酶穩定劑AES（ACE0070A）分別將T4標準品（貨號：DKY0346A）稀釋成5個梯度（液體型），進行37℃熱穩定性實驗。

d）T4標準品稀釋梯度（液體型）2-8℃熱加速7天與-20℃儲存7天發光值平均變化在±10%以內;

e）T4標準品稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與-20℃儲存7天發光值平均變化在±10%以內;

f）T4標準品抗原稀釋梯度（液體型）37℃熱加速7天與2℃-8℃儲存7天發光值平均變化在±10%以內;表明T4標準品在稀釋梯度（液體型）穩定性良好。

表3 T4標準品梯度（液體型）穩定性數據-T4標準品稀釋液2

2.3.3 酶解深水魚皮明膠與牛血清白蛋白臨床數據對比

a.采用酶解深水魚皮明膠（貨號：ACH0085J）配成發光稀釋液，用發光稀釋液分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標記T4抗體濃縮液配置成工作液；

b.采用牛血清白蛋白（貨號：DCL0001T）配成發光稀釋液，用發光稀釋液分別將磁珠包被T4抗體濃縮液、吖啶酯標記T4抗體濃縮液配置成工作液；

c.用a和b配成的工作液，分別測試TT4不同濃度的臨床樣本。如表4所示，兩種緩沖體系下臨床相關系數r均大于0.975，結果相當。含酶解深水魚皮明膠緩沖體系測試的信噪比更優。因此，在T4項目上，酶解深水魚皮明膠（貨號：ACH0085J）可替代牛血清白蛋白（貨號：DCL0001T）。

表4 酶解深水魚皮明膠與牛血清白蛋白臨床數據對比數據    

3.臨床相關性    

3.1化學發光（AE）平臺：    

3.1.1 西寶生物發光（AE）平臺TT4抗體配對組合1與羅氏診斷的TT4試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R²＞0.95，相關性較好；

   

3.1.2西寶生物發光（AE）平臺FT4抗體配對組合1與羅氏診斷的FT4試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R²＞0.95，相關性良好。

   

3.2化學發光（AP）平臺：    

3.2.1西寶生物發光（AP）平臺TT4抗體配對組合2與羅氏診斷的TT4試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R²＞0.95左右，相關性較好；

   

3.2.2西寶生物發光（AP）平臺FT4抗體配對組合2與羅氏診斷的FT4試劑（電化學發光法）賦值的臨床樣本相關性R²在0.94左右，相關性良好。

   

4. 測試方案    

4.1化學發光（AE）平臺    

4.1.1  TT4抗體配對組合1    

樣本:樣品加樣量10ul；

試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；

試劑3：總甲狀腺激素（TT4)解離液（發光專用）（貨號：DCH0209A）。

反應條件：    

第一步：10ul預稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2+50ul試劑3，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入預激發液及激發液，進行測試。

4.1.2  FT4抗體配對組合1    

樣本:樣品加樣量10ul；

試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標記-吖啶酯稀釋物，用量50ul/測試；

反應條件：    

第一步：10ul預稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入預激發液及激發液，進行測試。

測試使用發光儀器:科斯邁SMART 500S。    

4.2化學發光（AP）平臺    

4.2.1  TT4抗體配對組合2：    

樣本:樣品加樣量10ul；

試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；

試劑3：總甲狀腺激素（TT4)解離液（發光專用）（貨號：DCH0209A）。

反應條件：    

第一步：10ul預稀釋樣本+50ul試劑1+50ul 試劑2+50ul試劑3，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入底物，進行測試。

4.2.2  FT4抗體配對組合2：    

樣本:樣品加樣量10ul；

試劑1：T4抗體（貨號：EKY0325F）包被-磁珠稀釋物，用量50ul/測試；

試劑2：T4抗體（貨號：EKY0325G）標記-堿性磷酸酶稀釋物，用量50ul/測試；

反應條件：    

第一步：10ul預稀釋樣本+50ul試劑1+50ul試劑2混合，37℃孵育10min，清洗；

第二步：加入底物，進行測試。

測試使用發光儀器:迎凱Shine i2900。    

5.產品信息