摘要：新研究推翻了關于 CRISPR Cas9 的一個普遍假設。
21 世紀初，當科學家發現細菌如何保護自己免受病毒入侵者（噬菌體）的侵害時，他們幾乎不知道自己偶然發現了一種可用于編輯活細胞 DNA 的革命性工具。
這個名為 CRISPR 的系統被植入到細菌的基因組中，細菌可以通過儲存入侵者的基因片段（稱為間隔物）來“記住”過去的病毒攻擊。
在該系統最著名的版本 CRISPR-Cas9 中，這些存儲的記憶隨后被復制到微小的 RNA 向導中，這些向導 RNA 武裝 Cas9 蛋白，使其像武器一樣在細菌下次遇到匹配的噬菌體時切碎入侵者。
為了發動攻擊，Cas9 還依賴一種名為 PAM 的短 DNA 標簽，作為“可以在此處切割”的標志。
科學家已經修改了 CRISPR-Cas9 來編輯動物和人類細胞，甚至開發基因療法。
但關于 CRISPR-Cas9 系統如何運作的一個關鍵謎題尚不清楚：細菌如何形成新的免疫記憶？
圖1 Cas9通過感知CRISPR RNA豐度來調控CRISPR間隔序列的獲取
為了研究這個謎團，密歇根大學生物化學、微生物學和免疫學系的Yan Zhang博士實驗室發表了一篇論文，推翻了關于 Cas9 的一個普遍假設——即不與其通常的 RNA 伙伴結合，“空”或 apo 形式的 Cas9 是沒有功能的。
捕捉新的記憶
直到最近，只有少數基因研究闡明了 CRISPR-Cas9 如何形成免疫記憶，而且這些研究大多局限于 化膿性鏈球菌 （更廣為人知的名稱是 A 組鏈球菌）和 嗜熱鏈球菌 （常見于酸奶中）使用的 II-A 型系統。
在這些 II-A 系統中，Cas9 必須與其 RNA 伙伴之一 tracrRNA 協同工作，幫助選擇 PAM 旁邊的正確位置來捕獲新的記憶。
然而，在占 Cas9 家族 40% 以上的 II-C 型品牌中，記憶獲取過程尚不十分清楚。
Zhang教授的團隊，包括博士后研究員Xufei Zhou博士和博士生Xin Li，開發了一種用于研究記憶習得的新型模型系統，利用腦膜炎奈瑟菌 （可 導致腦膜炎），并用噬菌體感染它，以查看是否可以在實驗室環境下形成記憶，然后調整部分免疫機制以查看會發生什么。
“當我們開始這個項目時，Cas9 已經被稱為記憶獲取的 PAM 選擇器。
“這兩種 RNA 的作用尚不清楚，但我們假設它們對于 Cas9 幫助細菌獲得新記憶也一定具有某種重要性，”Zhang教授說。
新的墊片
噬菌體感染后，研究小組利用生物化學和計算生物學與生物信息學系的同事 Lydia Freddolino 博士和 Rucheng Diao 博士的深度測序和信息支持，檢查了 CRISPR 陣列的“生長”前導端。
在那里，他們看到來自病毒基因組的新間隔物被添加。
接下來，他們刪除了tracrRNA基因，并驚訝地發現間隔物的獲得得到了極大的刺激。
放回 tracrRNA 可使增強的獲取恢復到正常水平。
在他們對 crRNA 的研究中也出現了類似的模式：沒有 crRNA 時，Cas9 加快了獲取速度；而隨著 crRNA 的恢復，獲取速度又下降了。
Zhang教授說：“我們發現，沒有 RNA，記憶形成就會受到高度刺激，達到非常強勁的水平。”
“這對我們來說真的令人驚訝，我想說，對整個領域來說也是如此——因為Cas9一直以來都被認為需要RNA伴侶，無論是作為免疫效應器還是基因編輯器。這是首次報道非RNA負載的‘空’apoCas9的生物學功能。”
基于這些發現，他們提出 Cas9 可以作為 RNA 水平的監測器：當 CRISPR RNA 豐度較低時，表明細菌細胞攜帶較短的 CRISPR 和較少的免疫記憶，apoCas9 就會形成，并且可以動態地促進間隔區獲取，通過快速建立記憶庫來保護脆弱的細菌免受感染。
圖2 對于所有Northern和Western印跡實驗，上樣量對照與目的信號均在同一塊凝膠/膜上進行檢測。
短暫免疫記憶
研究小組進一步證明了細菌可能遇到 CRISPR 陣列過短的三種自然條件。
一個階段是最早的進化階段，此時陣列剛剛誕生，并且只包含很少（如果有的話）間隔內容。
在這個階段，Cas9 將沒有其 CRISPR RNA 伴侶，并且主要以 apo 形式存在。
第二種和第三種情況都涉及較長的 CRISPR 陣列突然坍縮為較短的陣列，這要么是細菌拋棄不需要的有害或自身免疫記憶以獲得新的有益特性的一種方式，要么是同源重組的結果，即兩個相似的 DNA 序列（又名 CRISPR 重復）交換片段，從而在此過程中抹去中間的 CRISPR 記憶。
這項研究擴展了 Cas9 的已知功能，并填補了 CRISPR-Cas9 如何維持記憶穩態的關鍵缺失部分。
這種動態反饋回路為細菌如何保護其免疫記憶的深度提供了一種新的思維方式。
它還可能啟發設計基于 CRISPR 的分子記錄或 DNA 條形碼工具用于研究和醫學的新方法。
參考資料
[1] Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition
摘要：新研究推翻了關于 CRISPR Cas9 的一個普遍假設。
21 世紀初，當科學家發現細菌如何保護自己免受病毒入侵者（噬菌體）的侵害時，他們幾乎不知道自己偶然發現了一種可用于編輯活細胞 DNA 的革命性工具。
這個名為 CRISPR 的系統被植入到細菌的基因組中，細菌可以通過儲存入侵者的基因片段（稱為間隔物）來“記住”過去的病毒攻擊。
在該系統最著名的版本 CRISPR-Cas9 中，這些存儲的記憶隨后被復制到微小的 RNA 向導中，這些向導 RNA 武裝 Cas9 蛋白，使其像武器一樣在細菌下次遇到匹配的噬菌體時切碎入侵者。
為了發動攻擊，Cas9 還依賴一種名為 PAM 的短 DNA 標簽，作為“可以在此處切割”的標志。
科學家已經修改了 CRISPR-Cas9 來編輯動物和人類細胞，甚至開發基因療法。
但關于 CRISPR-Cas9 系統如何運作的一個關鍵謎題尚不清楚：細菌如何形成新的免疫記憶？
圖1 Cas9通過感知CRISPR RNA豐度來調控CRISPR間隔序列的獲取
為了研究這個謎團，密歇根大學生物化學、微生物學和免疫學系的Yan Zhang博士實驗室發表了一篇論文，推翻了關于 Cas9 的一個普遍假設——即不與其通常的 RNA 伙伴結合，“空”或 apo 形式的 Cas9 是沒有功能的。
捕捉新的記憶
直到最近，只有少數基因研究闡明了 CRISPR-Cas9 如何形成免疫記憶，而且這些研究大多局限于 化膿性鏈球菌 （更廣為人知的名稱是 A 組鏈球菌）和 嗜熱鏈球菌 （常見于酸奶中）使用的 II-A 型系統。
在這些 II-A 系統中，Cas9 必須與其 RNA 伙伴之一 tracrRNA 協同工作，幫助選擇 PAM 旁邊的正確位置來捕獲新的記憶。
然而，在占 Cas9 家族 40% 以上的 II-C 型品牌中，記憶獲取過程尚不十分清楚。
Zhang教授的團隊，包括博士后研究員Xufei Zhou博士和博士生Xin Li，開發了一種用于研究記憶習得的新型模型系統，利用腦膜炎奈瑟菌 （可 導致腦膜炎），并用噬菌體感染它，以查看是否可以在實驗室環境下形成記憶，然后調整部分免疫機制以查看會發生什么。
“當我們開始這個項目時，Cas9 已經被稱為記憶獲取的 PAM 選擇器。
“這兩種 RNA 的作用尚不清楚，但我們假設它們對于 Cas9 幫助細菌獲得新記憶也一定具有某種重要性，”Zhang教授說。
新的墊片
噬菌體感染后，研究小組利用生物化學和計算生物學與生物信息學系的同事 Lydia Freddolino 博士和 Rucheng Diao 博士的深度測序和信息支持，檢查了 CRISPR 陣列的“生長”前導端。
在那里，他們看到來自病毒基因組的新間隔物被添加。
接下來，他們刪除了tracrRNA基因，并驚訝地發現間隔物的獲得得到了極大的刺激。
放回 tracrRNA 可使增強的獲取恢復到正常水平。
在他們對 crRNA 的研究中也出現了類似的模式：沒有 crRNA 時，Cas9 加快了獲取速度；而隨著 crRNA 的恢復，獲取速度又下降了。
Zhang教授說：“我們發現，沒有 RNA，記憶形成就會受到高度刺激，達到非常強勁的水平。”
“這對我們來說真的令人驚訝，我想說，對整個領域來說也是如此——因為Cas9一直以來都被認為需要RNA伴侶，無論是作為免疫效應器還是基因編輯器。這是首次報道非RNA負載的‘空’apoCas9的生物學功能。”
基于這些發現，他們提出 Cas9 可以作為 RNA 水平的監測器：當 CRISPR RNA 豐度較低時，表明細菌細胞攜帶較短的 CRISPR 和較少的免疫記憶，apoCas9 就會形成，并且可以動態地促進間隔區獲取，通過快速建立記憶庫來保護脆弱的細菌免受感染。
圖2 對于所有Northern和Western印跡實驗，上樣量對照與目的信號均在同一塊凝膠/膜上進行檢測。
短暫免疫記憶
研究小組進一步證明了細菌可能遇到 CRISPR 陣列過短的三種自然條件。
一個階段是最早的進化階段，此時陣列剛剛誕生，并且只包含很少（如果有的話）間隔內容。
在這個階段，Cas9 將沒有其 CRISPR RNA 伴侶，并且主要以 apo 形式存在。
第二種和第三種情況都涉及較長的 CRISPR 陣列突然坍縮為較短的陣列，這要么是細菌拋棄不需要的有害或自身免疫記憶以獲得新的有益特性的一種方式，要么是同源重組的結果，即兩個相似的 DNA 序列（又名 CRISPR 重復）交換片段，從而在此過程中抹去中間的 CRISPR 記憶。
這項研究擴展了 Cas9 的已知功能，并填補了 CRISPR-Cas9 如何維持記憶穩態的關鍵缺失部分。
這種動態反饋回路為細菌如何保護其免疫記憶的深度提供了一種新的思維方式。
它還可能啟發設計基于 CRISPR 的分子記錄或 DNA 條形碼工具用于研究和醫學的新方法。
參考資料
[1] Cas9 senses CRISPR RNA abundance to regulate CRISPR spacer acquisition
